全自动化生化分析仪的参数设置

1.分析方法 常见的分析方法有:终点分析法、连续监测法、比浊测定法。

1.1 终点分析法 

1.1.1 一点终点法 该法的特点是使用一种或两种试剂,待测定物与试剂反应达到终点时,测定吸光度,计算待测物的浓度。该法常见的有总蛋白双缩脲法、白蛋白溴甲酚绿法、葡萄糖氧化酶法。 

1.1.2 两点终点法 也称固定时间法。在单试剂分析中,该法可以消除样品以及试剂的颜色、浊度的干扰,其原理是 在样品与试剂混合后的延滞期后读取一个点A1,一定时间后读取A2,ΔA=A2-A1,然后比较标准和测定的ΔA值,求得待测物的浓度。单试剂分析常见的 有肌酐苦味酸法。在双试剂分析中,该法还具有消除内源性物质测定的干扰,其原理是加入试剂1后读取A1,加入试剂2后读取A2,A1相当于读出样品空白 值,A2才是实际呈色反应,因此ΔA=A2-A1。

1.2 连续监测法 其原理是在酶促反应的最适条件下,用物理、化学或酶促反应的分析方法,在反应速度恒定期(零级反应期)来连续观察和记录一定反应时间内底物或产物量的变化,以单位时间酶反应初速度计算出酶活力的大小和代谢物的浓度。其具体方法有两点速率法和多点速率法。

1.2.1 两点速率法 观察在零级反应期内两个时间点的吸光度,用两个点的吸光度的差值(ΔA)除以时间(分),计算出每分钟的吸光度变化值。

1.2.2 多点速率法 在酶促反应进程的零级反应期内每隔一定时间(2-30s)进行一次监测,连续监测多次,求出单位时间内的反应速度。

1.3 比浊测定法 自动化生化分析仪一般只能做透射比浊分析,其原理是在光源的光路方向测量透过光强度,它常用于终点法测定,目前应用较多的为免疫透射比浊法。目前主要用于血清特种蛋白的检测,如载脂蛋白、微量蛋白、急性时相反应蛋白、免疫球蛋白以及某些药物监测等。

2. 温度 一般生化分析仪的恒温控制器可以对25℃、30℃、37℃三种温度进行恒温,根据需要可以任意选择。由于酶在达到最适温度以前,温度每升高10℃,反应速率增加1-2倍,因此IFCC推荐酶测定时的温度设置为37℃。

3.波长

3.1 单波长 当测定体系中含有一种组分或在混合溶液中待测组分的吸收峰与其他共存物质的吸收波长无重叠时,可选用。如果一个物质有几个吸收峰,可选用吸光度最大的一个波长,或者选择在吸收峰处吸光度随波长变化较少的某个波长。  

3.2 双波长 当被检溶液混浊或存在较多的干扰物质时,测定时会出现光散射和非特异性光吸收,从而影响测定结果的 准确性,此时可用双波长测定,以提高测定结果的准确性,而在实际应用中选择辅助波长主要用于消除脂血、溶血、黄疸的干扰。由于脂质、血红蛋白、胆红素在较 宽的波长范围内有较强的光吸收,常常同测定波长有重叠,此时测得的吸光度包含待测物质的吸光度和干扰物质的吸光度,因此选用合适的辅助波长可以消除干扰物 质的吸光度。辅助波长的设置原则是根据测定波长选择辅助波长,要求干扰物质在测定波长同辅助波长有相同的吸光度。

4. 样品量和试剂量 样品和试剂量的设置原则一般是根据试剂说明书上的比例,并结合仪器的特性进行设置。仪器的特性包括:样品和试剂的最小加样量及加量范围、最小反应液的体积等。在实际工作中为节约成本可以根据比例缩小样品和试剂用量,但同时必须满足最小反应液总量。但值得注意的是,样品量不应少于3μl,否则测试结果的重复性差。

5. 稀释水量 添加样品稀释水的目的是为了洗出粘附在采样针内壁上的微量血清,减少加样误差,添加试剂稀释水的为了避免试剂间交叉污染,两种稀释水的量应在复溶试剂时按 比例扣除。如用液体试剂盒时因不再加水,无法扣除稀释水量,所以两种稀释水的量应尽量减少,以免试剂被过量稀释。

6. 孵育时间 在终点分析法中,孵育时间的选择应充分考虑到干扰问题。在白蛋白溴甲酚绿法中,血清中α1-球蛋白、转铁蛋白、触珠蛋白等亦可与溴甲酚绿呈色,但其反应速 率较白蛋白为慢,而实际上,当血清与白蛋白混合时,“慢反应”已经发生,因此在溴甲酚绿与血清混合后30s读吸光度可明显减少非特异性结合反应。在葡萄糖 氧化酶法中,葡萄糖氧化酶高特异性催化β-D-葡萄糖,而血清中葡萄糖α和β构型各占36%和64%,要使葡萄糖完全反应,必须延长孵育时间使α-葡萄糖 变旋为β构型。此外,总胆固醇、甘油三酯都采用酶法的Trinder反应进行测定,但该反应37℃反应较慢,必须测定这些酶试剂反应达到终点的时间,自动 分析仪用试剂盒一般可以在全部加样后5min内反应完全,所以应该选择分析仪的最大反应时间。

7. 延迟时间 在酶促反应一开始的阶段,由于各种因素的影响,酶促反应速率比较慢,可以是几秒到几分钟,尤其是双底物反应或需要辅酶参与者,通常为1-3min。而一般单试剂法只需30s,常用项目中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶需要特别注意。

8. 监测时间 酶促反应延滞期后,在过量底物的存在下,反应速率加快并达到一个反应速率稳定的阶段,即酶促反应以恒定的速率进行,不受底物浓度的影响,这段时间称为线性 反应期或零级反应期,自动化生化分析仪的监测时间即为此期。测酶的连续监测法至少90-120s或至少4点(3个ΔA),少于3个ΔA不能称为连续监测 法,因为不能计算线性度。监测时间过长则容易发生底物耗尽,可测范围变窄。

9. 试剂吸光度上限、下限 试剂吸光度上限为正向反应用,可参考试剂盒说明书数值折算成所用比色杯的光径。如试剂盒要求上限为0.4,比色杯光径0.8cm,则试剂吸光度上限设置为0.32。 试剂吸光度下限为负向反应用,设置法同试剂吸光度上限。 超过限额表示试剂已变质,应更换合格试剂。

10.底物耗尽限额 不同型号分析仪的设计不一样,有的为零点与监测第一点吸光度的差额,有的为吸光度上升或下降至指定吸光度的数值。超过限额说明样品的酶活性非常高,底物消 耗太快,在仪器程序规定的线性反应期内吸光度的变化往往不代表真正的酶活力,导致结果偏低,样品应稀释5-10倍后重测。

11.线性度 线性度是指“线性错误”或“线性误差”,其计算公式为:(A1-A2)/A3 × 100%,式中:A1为前2/3读数时间的斜率,A2为后2/3读数时间的斜率,A3为总的斜率。线性百分数大,说明ΔA之间已不成线性,超过限额说明底 物不足,检测结果会变低,应稀释后重测。

12.试剂空白速率 试剂空白速率为试剂在监测过程中底物自动降解得到的结果。其值为以水代样品测得的项目结果,样本测定结果应扣除试剂空白速率。

13.线性范围 按试剂的质量而设置,超过范围应增加样品量或稀释后重测。不同试剂公司的试剂质量不一样,不同样品试剂比的线性范围也不一样,应实测试剂盒的线性范围。终 点法可配制系列不同浓度的标准液,按分析项目的波长、样品量、试剂量、孵育时间,测定各浓度的吸光度,绘制标准曲线,在线性内的最高浓度为线性上限。

14.计算因子F值(或系数K)

14.1 理论F值 用连续监测法进行酶活性测定时,不需作标准管或标准曲线,根据摩尔消光系数很容易进行酶活性浓度的计算。先测定在线性范围内每分钟吸光度的变化(ΔA/min),以U/L代表酶活性浓度时,则可按下式进行计算: U/L=ΔA/min=ΔA/min×V×106/(ε×v×1) 式中V:反应体系体积(ml);ε:摩尔吸光系数(cm2/mol);v:样品量(ml);l:比色杯光径(cm);ΔA:吸光度变化;106:将mol换算成μmol。 因此当条件固定时,从理论上讲V、v和l均为固定值,ε为常数,则上述公式可以简化为U/L=ΔA/min×F,F=V×106/(ε×v×1)。 系数F值对酶的测定十分重要,过高虽然测定的线性较宽,但重复性差,反之,虽然精密度好,但检测线性窄,因此应根据实际情况进行合理的设置和应用,F值的设置应参考酶参考值的上限及测定时间两方面,以保证测定结果的可靠。

14.2 实际F值 在临床实际工作中,仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小、比色杯光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会影响指示物的ε值或上述公式中的相关项。因此,应在具体仪器条件下,定期检查和实际测定指示物的ε和系数F值(即仪器的实测F值)。 NAD(P)H的ε值因NAD(P)H不稳定,可用葡萄糖的己糖激酶法实测,其原理为: GLU + ATP----HK ---- G-6-P + ADP ; G-6-P + NAD(P)+ ---- G-6-PD ---- 6-磷酸葡萄糖酸 + NAD(P)H + H+ 将某一浓度的葡萄糖溶液(可设为10 mmol/L)重复5-10次测定,得到相应的吸光度,求出A bar±s,s必须低于仪器规定的批内允许值。根据ε =A bar/(C×l)× V/v求出NAD(P)H的实际ε值,式中C为标准液浓度(mol/L);l为比色杯光径(cm);V为反应总体积(ml);v为样品体积(ml)。再根 据U/L=ΔA/min × F,得到实际F值= C×106/A bar。 此外,一些色素源指示物在不同的介质环境中,其ε会发生程度不等的变化。对于对硝基苯酚、对硝基苯胺和5-硫代-2-硝基苯甲酸等测这类可得到高纯而稳定的指示物,可将其配置在一定的介质中,按临床标本用的现场试剂和仪器测定吸光度求实测ε及实侧F值。

15. 前区检查 免疫比浊分析过程中必须设置。比较免疫比浊分析过程中后两个读数点的差别,如果后一点比前一点的吸光度低,则表示抗原已过剩,应将样品稀释后重测。

16. 线性回归方程 以标准液代样品在仪器上测得的结果为横坐标,标准液的实际浓度为纵坐标绘制而成的曲线,其中A为曲线在纵轴上的截距,B为曲线的斜率,用于修正检测结果。


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